2. 应用场景： 反射式共聚焦显微成像凭借免标记、无创光学断层的特点，拥有丰富的应用场景。在临床医学中，该技术最常用于皮肤科，可在不进行组织活检的前提下，对色素痣、黑色素瘤、基底细胞癌等皮损开展活体筛查与疗效随访；同时也应用于眼科，实现角膜上皮、基质胶原的在体观测，辅助评估角膜病变与移植条件。科研领域可用于黏膜组织、组织工程支架的微观结构观察。材料与工业检测方面，能够检测薄膜、复合材料、光学元件的表面及亚表面缺陷、界面形貌与涂层结构。受成像深度限制，该方法适合表层微观结构的快速、无损评估。

图1：反射式共聚焦的皮肤组织成像  图片源自： Chin J Dermatol, September 2024, Vol. 57, No. 9

二 、使用NCF1000反射式共聚焦观察晶体结构

1.  晶体表面成像

       本次实验中用户采用20X 0.75物镜对晶体碎片进行反射式共聚焦成像。软件内切换为反射式共聚焦模式，根据实验材料选择适宜波长的激光，NCF1000常规配置 405 nm、488 nm、561 nm、640 nm 激光器。在物镜数值孔径与介质折射率保持不变时，光学层切厚度随激光波长增加而增大。405 nm 可实现最薄的光学切片，轴向分辨最优，但组织光散射强、穿透深度有限；随波长增至 488 nm、561 nm，层切厚度逐步增加，组织穿透能力提升；640 nm 的层切厚度在四者中最大，轴向分辨最弱，却能有效降低生物组织散射，获得更深成像。选择激光时，需权衡轴向切片精度、荧光探针匹配与组织穿透深度。调节合适的激光和增益强度，推荐小孔大小切换至1.5-2AU。

图2：晶体表面成像

拍摄条件:

显微镜：NCF1000反射式共聚焦显微镜

物镜：20X  NA：0.75

分辨率：2048 X 2048像素点

激光：488nm    小孔：1.5AU

2.  晶体3D结构成像

       NCF1000反射式共聚焦同样可进行Z-Stack拍摄，并使用Nomis Pro X_C软件进行三维重构。

图3：晶体3D结构成像

图4：切片模式可用于观察不同位置的层切信号

四 、实验过程中可能遇见的问题

Q1：Z-Stack模式成像时，保存的原始文件是否可以保存到一个文件夹中？

A1：目前Nomis Pro X_C软件保存的Z-Stack扫描原始文件，暂不支持保存到一个文件夹中。

注意事项：在对晶体进行反射式共聚焦成像时，需要注意样品与物镜之间的距离。防止晶体划伤物镜镜头。